基于“十八反”的中药配伍禁忌理论基础研究

【摘要】本论文研究工作为国家重点基础研究发展计划(973计划)项目：基于“十八反”的中药配伍禁忌理论基础研究——“藻戟遂芫俱战草”配伍关系与毒效表征的基础研究中的部分研究内容。本论文共分为4章,各章节的主要内容及研究结果如下：一、文献研究海藻与甘草配伍禁忌是中药十八反“藻戟遂芫俱战草”的组成部分,历代诸多本草书籍中均有记载。2010版《中华人民共和国药典》中采纳了“十八反”的内容,在海藻注意项下标明“海藻不宜与甘草同用”。在对相关文献整理基础上,综述了海藻与甘草配伍禁忌形成的源流以及配伍禁忌的物质基础、生物效应、临床应用等现代研究现状,并在此基础上设计本论文的研究思路与方案。二、海藻与甘草配伍毒效表征及其作用机制研究(一)海藻-甘草反药组合的毒性评价1.海藻、甘草各单味药对小鼠急性毒性评价对海蒿子水提物进行了急性毒性实验,得出的时间-死亡率曲线。结果表明：海蒿子的LD50为30g/kg,95%置信限为26.1-33.9g/kg。并对不同产地、不同基源的海藻进行急性毒性研究,实验结果表明在海蒿子和羊栖菜30g/kg(为药典高限剂量的19倍)时对小鼠灌胃给药,均对小鼠表现出一定的急性毒性,且毒性反应相同。甘草以最大浓度给药(为甘草药典高限剂量的48倍)时,未发现明显毒性反应和小鼠死亡。2.海藻-甘草反药组合对大鼠多次给药毒性评价为了确定海藻与甘草反药组合在大鼠体内的毒性靶器官和毒性剂量,设计了多次灌服(8周)给予大鼠不同剂量海藻与甘草配伍药组水提物。结果显示：海藻-甘草合用导致大鼠血中乳酸脱氢酶和羟丁酸脱氢酶含量升高,病理组织检查显示心肌炎性病变；海藻-甘草合用导致大鼠血中谷草转氨酶升高,肝脏点状坏死；海藻-甘草合用升高大鼠血中肌酐含量,病理组织检查显示肾脏间质性炎；氯离子与正常组相比显著降低；综上,海藻-甘草反药组合会导致体内电解质平衡失调,海藻-甘草反药组合在大鼠体内的毒性靶器官为心脏、肝脏和肾脏。(二)海藻对甲状腺肿大模型大鼠的影响为了考察海藻单煎液对实验性大鼠甲状腺肿大的影响,探讨海藻治疗甲状腺肿大的剂量和可能机理,设计海藻对甲状腺肿大模型大鼠的效应评价。甲状腺指数结果表明：模型组和给药组与正常组相比甲状腺指数显著升高。阳性组、海藻低剂量和海藻高剂量组的大鼠甲状腺指数低于模型组,但无显著性差异。表明海藻和阳性对照药左甲状腺素钠具有一定的消肿功效。大鼠血清中甲状腺激素的检测结果表明：模型组和各药组的T3、T4和TSH与正常组相比,无显著性差异。(三)海藻与甘草反药组合对大鼠体内电解质的影响海藻中富含钠钾钙镁等元素,且含量显著高于陆生植物,甘草中也富含很多的无机元素,而且甘草中的甘草皂苷具有盐皮质激素样作用。两药合用,是否会导致体内电解质失调,进而产生一系列的副作用?对此,本研究设计了海藻与甘草反药组合对大鼠水盐代谢的影响的实验。单次和多次给药后尿量测定结果表明海藻的传统功效利水消肿并不是通过利尿途径实现的；单次和多次给药后对尿中电解质测定结果表明海藻和海藻-甘草组使得钠离子、氯离子和镁离子含量显著升高；多次给药后对大鼠血清电解质的测定结果表明海藻-甘草合用后会导致镁离子和钠离子含量高于单用海藻组,且与对照组有显著差异。提示两药合用会导致体内电解质代谢平衡失调,这可能是海藻与甘草相反的可能机制之一三、海藻-甘草配伍毒效物质基础研究(一)海藻化学成分分离与结构鉴定迄今对海蒿子的化学成分研究主要集中在褐藻糖胶的分级纯化和结构分析上,而对其中小分子化学成分的研究较少。为进一步研究该中药的活性成分,本实验从海蒿子的醇提物中分离得到7个化合物,分别鉴定为棕榈酸-α-单甘油酯(1)、十八烷(2)、棕榈酸(3)、马尾藻甾醇(4)、甘草苷(5)、甘露醇(6)和尿嘧啶(7)。其中化合物1、5和7是首次从海蒿子中分离得到的化合物。(二)不同产地海藻化学成分的分析与评价1.不同产地海藻无机元素的分析与评价基于微波消解-ICP-AES法、碘离子选择性电极法分别评价了不同产地海藻药材中包含有益元素和有害元素共计30种无机元素的含量及分布特征。结果表明不同产地海藻含有19～26种无机元素,无机元素平均含量按由高到低的顺序依次为K>Ca>Na>Mg。25批海藻样品有害元素Cu平均值为7.83mg/kg,Hg为1.54mg/kg,Pb为3.07mg/kg,Cd为3.02mg/kg,As为109.35mg/kg,A1为1434.26mg/kg。海蒿子与羊栖菜大部分元素无显著性差异。2.不同产地海藻砷化学形态分析采用电感耦合等离子体-原子发射光谱(ICP-AES)对不同产地的18批中药海藻样品中的总砷进行测定,并采用HPLC-HG-AFS分析中药海藻中水可溶性砷的不同存在形态和含量。结果表明中药海藻中水可溶性砷形态有As(Ⅲ)、DMA、As(Ⅴ)。总砷含量为20.12-170.7mg/kg(干重),在大多数中药海藻样品的水可溶性砷形态中无机砷为主要砷形态,含量为9.836-97.73mg/kg,占总砷比例为24.99%-89.54%。中药海藻中总砷显著高于《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中砷≤2.0mg/kg的限量标准。无机砷显著高于GB19643-2005《藻类制品卫生标准》中规定藻类制品中无机砷限量(干重计)≤1.5mg/kg的标准。3.不同产地海藻核苷和氨基酸类成分的分析与评价采用UPLC-TQ-MS对常见褐藻中的核苷和氨基酸类成分进行分析,并进一步采用主成分分析方法对样品进行评价。结果显示测定的褐藻中富含核苷和碱基类成分,含量范围为48.46μg/g到4105.00μg/g。22种氨基酸的总量范围为0.14mg/g-22.76mg/g。PCA结果表明基于核苷、碱基和游离氨基酸的含量,海蒿子和羊栖菜具有相似的化学特征。(三)海藻-甘草合用前后的体外化学成分变化研究1.UPLC/Q-TOFMS分析海藻-甘草配伍化学成分的变化采用UPLC/Q-TOFMS技术,结合MassLynx4.1统计软件进行数据分析,探讨海藻与甘草配伍煎煮对其化学成分的影响。海藻甘草合煎液较合并液,皂苷类成分甘草皂苷A3、22-Acetoxyl-glycyrrhizin和甘草皂苷G2的含量显著增加,而黄酮类成分甘草素-4’-芹糖苷、甘草苷和异甘草素葡萄糖芹菜苷的含量显著降低。2.海藻-甘草不同比例配伍的化学成分变化采用UPLC-TOFMS,考察甘草海藻配伍对组分溶出规律的影响。结果表明,在甘草与海藻不同比例配伍时,来自甘草中的主要成分溶出增加,其中甘草素-4’-芹糖苷、甘草苷和甘草酸的量显著增加。3.海藻-甘草不同比例配伍对总砷及砷形态含量的影响以不同比例配伍的海藻-甘草为研究对象,采用电感耦合等离子体-原子发射光谱(ICP-OES)和高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱在线联用技术(HPLC-HG-AFS),探讨海藻-甘草不同比例水煎过程中化学成分的变化。测定结果表明：海藻-甘草不同比例配伍会导致总砷、As(Ⅲ)、DMA含量升高,对As(V)的溶出影响不显著,表明海藻-甘草混合煎煮由于相互作用会促进砷的溶出增加,导致两药合煎后毒性增强。甘草能促使海藻中毒性砷的溶出提高,导致毒性增强。海藻中毒性成分溶出增加是海藻与甘草配伍禁忌的可能机制之一。(四)海藻毒性成分的体内过程研究应用HPLC-HG-AFS对海蒿子水提液灌胃给予大鼠的药代动力学过程进行研究。结果表明,As(V)在大鼠体内分布和消除很快,DMA相对消除较慢。曲线下面积和最高血药浓度显示剂量依赖性关系。四、基于甲状腺肿大模型的海藻-甘草配伍量-毒-效关系研究选用大鼠甲状腺肿大模型对海藻-甘草的量-毒-效进行研究。分别以海藻(海蒿子、羊栖菜)药典低限剂量、高限剂量、高限2倍；甘草药典低限剂量、高限剂量、高限2倍设定26个配比组,实验通过观察甲状腺肿大模型大鼠的甲状腺激素和甲状腺组织切片等指标来评价海藻治疗甲状腺肿大的药效学,通过血液生化指标及病理组织学对海藻和甘草配伍的毒理学进行评价,综合分析海藻-甘草对甲状腺肿大模型大鼠的量-毒-效关系。量-效评价结果表明海蒿子、羊栖菜单味药和海蒿子-甘草和羊栖菜-甘草均能升高大鼠体内的甲状腺激素T3、T4、FT3、FT4水平,对丙硫氧嘧啶导致的甲状腺激素水平失调具有恢复作用。药典低限剂量海蒿子与药典低限甘草合用不影响药效；与药典高限和药典高限2倍剂量甘草合用影响药效,表现为FT4显著高于正常组。药典低限剂量羊栖菜与药典低限和高限剂量甘草合用不影响药效；与药典高限2倍剂量甘草合用影响药效,表现为T4降低,与模型组无差异；药典高限剂量羊栖菜与药典低限和高限剂量甘草合用不影响药效；与药典高限2倍剂量甘草合用影响药效,表现为FT4显著高于正常组。量-毒评价结果表明对于甲状腺肿大模型大鼠,海蒿子在药典高限剂量Cr与正常组和模型组相比有显著差异,提示肾脏毒性。羊栖菜在药典低限剂量TP与正常组和模型组相比有显著差异,提示肝脏毒性；羊栖菜在药典高限2倍剂量BUN与正常组和模型组相比有显著差异,提示肾脏毒性。海蒿子-甘草合用会对肝、肾有影响；羊栖菜-甘草合用会对肝脏和血脂有影响。
【作者】曹琰；
【导师】段金廒；
【作者基本信息】南京中医药大学，中药学，2014，博士
【副题名】中药海藻与甘草配伍毒效表征与物质基础研究
【关键词】中药配伍禁忌；十八反；反药组合；海藻；甘草；

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